Al igual que su padre y su abuelo, Leoš debía hacerse también maestro. A sus 11 años lo enviaron a la fundación del monasterio de Staré Brno, que recibía a chicos pobres con vocación musical. Aquí, bajo la tutela del compositor Pavel Krízkovský, Janáček adquirió conocimientos prácticos de música y se acostumbró a un riguroso régimen de trabajo que mantuvo durante toda su vida.

Después de acabar el instituto de maestros en Brno, el joven Janácek se fue a Praga a estudiar en la escuela de organistas. El arte de componer lo perfeccionó en Leipzig y Viena. Luego regresó a Brno, ciudad en la que desarrolló su vida privada y profesional.  Allí trabajó como director de coro y de orquesta, organista, profesor de música.

Desde las vacaciones de 1888 Janáček regresaba regularmente a su pueblo natal de Hukvaldy, sólo o acompañado por su familia y sus amigos artistas.

Del mismo año data el principio de su investigación sistemática sobre canciones y bailes populares moravos, en la que le ayudaba el folklorista Frantisek Bartos. En su región natal, Lassko y Valaquia, Janáček empezó a recopilar y editar la música folclórica. "Los Bailes de Lassko" o "Reinas" fueron los primeros resultados de esos estudios.

En agosto de 1917 Leoš Janáček empezó a componer el ciclo de canciones para tenor, contralto y tres voces femeninas con piano, "El diario de un desaparecido". Su amor tardío, Kamila Stösslová, y unos versos publicados en el diario Lidové Noviny le sirvieron de inspiración.

En un pueblo montañoso de Moravia Oriental desapareció el único hijo de una familia de campesinos. Todos creían que le había pasado una desgracia o que se había convertido en víctima de un crimen. Unos días más tarde encontraron, en el cuarto del joven, su diario. Contenía 23 poemas cortos en los que el chico confesaba su amor hacia una joven gitana, con la que junto a su hijo en común decidió escaparse.

Fuera de la tradición de Smetana y Dvořák, Leoš Janáček sentía afición por componer para coro. "El maestro Halfar", "Marycka Magdonova" y "70 000", obras basadas en las baladas del poeta silesiano Petr Bezruc, surgieron como protesta contra la represión social y nacional.

En estas composiciones Janáček logra impactar realmente los sentimientos del auditorio: durante su representación el público llegaba a desmayarse.

El compositor y el poeta no se conocieron personalmente. Bezruc trabajaba en la oficina de correos de la estación de Brno, donde también Janáček disponía de un apartado. Cuando Janáček partió hacia Hukvaldy fue a anunciar el cambio de dirección, de lo que estaba encargado Bezruc.

Así se veían, sin embargo, sin intercambiar una sola palabra, ni estrecharse la mano, y sin que Janáček sospechara que el empleado de correos era el autor de esos poemas que expresaban la misma rebeldía con la que él mismo había crecido.

La obra de Janáček para coro y orquesta culminó con la Misa Glagólica, un himno a la creencia en el hombre y de alabanza a la vida, que el compositor escribió en 1926, a sus 72 años de edad, en base a un texto litúrgico en lengua eslava antigua.

Durante años, Janáček fue un compositor cuya obra era conocida sólo por el público de la ciudad de Brno. "Sárka", la primera ópera que compuso, inspirado en un episodio de amor de la leyenda checa sobre la rebelión de las mujeres, fue estrenada muchos años después de su composición.

La segunda, "El principio de una novela", basada en un cuento de Gabriela Preissová, la escenificó el mismo compositor en 1894, y fue por primera y última vez que Janáček se puso ante la orquesta para dirigir una ópera.

Su tercera ópera, Jenufa, según el libreto de Gabriela Preissová, la acababa en uno de los momentos más trágicos de su vida, al morir su joven hija Olga. Varios años antes había perdido a su único hijo varón, Vladimír.

Después del estreno de "Jenufa" en Brno, el 21 de enero de 1904, Janáček tuvo que esperar doce años hasta que la ópera subiera al escenario del Teatro Nacional de Praga. Con "Jenufa" se le abrieron, por fin, las salas y teatros fuera de Brno, no sólo en el país, sino también más allá de las fronteras.

Animado por el éxito, Janácek, a los 62 años de edad, se sumerge con entusiasmo en la composición. Surge "El Destino", la ópera más personal e íntima de Leos Janácek, inspirada por su relación hacia la señora Kamila Urválková, que el compositor conoció en el balneario de Luhacovice.

Le siguen óperas como "Excursiones del señor Broucek", en que se burla del carácter provincial, "Katya Kabanova", a cuya protagonista, el amor y la sociedad empujan hasta el suicidio, y "La zorrita astuta", para la que le sirvió de inspiración un relato del escritor checo, Rudolf Tesnohlídek. La historia de la zorrita astuta fue publicada a continuación en el periódico Lidové Noviny. Basándose en ella, el mismo Janáček escribió el libreto, y en otoño de 1923 acabó la ópera amable en que los destinos humanos se reflejan en los destinos de los animales.

En 1926 fue estrenada la ópera "Caso Makropulos". Como última surgió "De la casa de los muertos", cuyo estreno en 1930 el compositor ya no llegó a ver.

En el año 1888 visitó Praga Piotr Ilych Chaikovski. Leoš Janáček asistió al concierto en que se presentó la obra del compositor ruso y se encontró con el autor personalmente. Varios años más tarde, Janáček se convirtió en uno de los fundadores del Círculo Ruso en Brno, que inició sus actividades en mayo de 1898 con una velada de conferencias dedicadas a la obra de León Tolstoi.

En 1905 Janáček leyó en su idioma original el relato de Nikolai Gogol sobre el atamán cosaco "Taras Bulba". Inspirado por esta historia, compuso la rapsodia homónima para orquesta, por la que en 1924 obtuvo el Premio Estatal de la República Checoslovaca.

Mientras que la estrella profesional de Janáček ardía cada vez con mayor fuerza, su vida privada no era tan exitosa. En 1881 Leoš Janáček se casó con Zdenka Schulzová, la que el día de su boda aún no había cumplido 16 años. Permanecieron juntos hasta el resto de su vida, pero su relación no era muy feliz.

El amor real lo encontró Janáček en la joven Kamila Stösslová, a quien vio por primera vez en julio de 1917, durante su estancia estival en Luhacovice. La amistad con Kamila, que estaba casada, se convirtió en una fuerte relación emocional. Janáček dirigió a Kamila casi 730 cartas. Su amor no se consumó, pero fue Kamila Stösslová quien inspiró a Janácek para escribir, entre otras obras, su Segundo Cuarteto de Cuerdas "Cartas íntimas".

En su pueblo natal de Hukvaldy, acompañado por su amor tardío, Kamila Stosslová, Janáček pasaría los últimos momentos felices de su vida, en el verano de 1928. El 8 de agosto el compositor cayó enfermo de pulmonía. Dos días más tarde lo trasladaron al hospital, en la cercana ciudad de Ostrava. El 12 de agosto de 1928 a las diez de la mañana Leoš Janáček falleció.